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详细介绍
D-LUCIFERIN SODIUM SALT
基本特性:
1)CAS NO:103404-75-7
2)化学名:(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid sodium salt; D-Luciferin firefly, sodium salt monohydrate;
3)分子式:NaC11H7N2O3S2· H2O
4)分子量:320.32 g/mol
5)纯度:>99% (HPLC),分子生物学级(超纯)
6)外观:浅黄色至黄色粉末
7)溶解性:溶于水(高达100 mg/ml)
使用方法:
1.体外生物发光检测
1) 储存液制备用蒸馏水溶解D-LUCIFERIN SODIUM SALT,配制成15mg/ml的储存液(100×),混匀后立即使用或分装于-20℃或-80℃冻存,避免反复冻融。建议使用的工作液浓度为150µg/ml(相当于468µM)。
2) 荧光素酶反应缓冲液制备配方【1×,参考Yuichi Oba, et al., 2003】:100mM Tris-HCl(pH 7.8),5mM MgCl2,250µM CoA,150µM ATP。具体缓冲液组成可参考其他文献资料来调整。按照以上配方制备荧光素酶反应缓冲液(2×)。
3) 收集细胞裂解上清(荧光素酶表达)根据需要检测的细胞类型,选择合适的裂解液进行细胞裂解,离心收集上清后续检测待用。
4) 萤火虫荧光信号检测
【1】:萤火虫荧光信号的检测方法大体上取决于冷光测定仪(luminometer)类型(是手动型荧光计、单管注射型或者酶标板读数型荧光计)。根据特定发光测定仪,来考虑注射用量和程序设置。
【2】:需设置不含荧光素酶的孔(用作阴性对照),以测定背景荧光。例:注射式冷光测定仪(injectible luminometer,单样或微孔板,200µl终体积)
a)吸取100µl荧光素酶反应缓冲液(2×)到一干净的冷光测定仪比色皿或96孔板的各孔(最好使用全白平底的96孔板);
b)吸取50~98µl裂解上清到皿或孔内;
c)如果有需要,用水来补足使得总体积到198µl;
d)设置程序注射2µl荧光素储存液(使工作浓度150µg/ml),程序:2~5秒延迟(delay),之后10s测定。
2.活体成像分析
1)用无菌的PBS(w/o Mg2+)或者DPBS(w/o Mg2+)配制D-荧光素(钠盐)工作液(15mg/ml),0.2µm滤膜过滤除菌。混匀后立即使用或分装于-20℃或-80℃冻存,避免反复冻融。一旦使用,放到4℃解冻,保持冰冷且避光。
2)注射量取决于注射方式,具体如下:注射方式剂量静脉注射(25-27 gauge针头)按10µl/g体重浓度,加入相应体积的15mg/ml荧光素工作液 腹腔注射(25-27 gauge针头)按10µl/g体重浓度,加入相应体积的15mg/ml荧光素工作液肌肉注射(27 gauge针头)50µl,浓度为1-2mg/ml荧光素工作液鼻内注射(pipette)50µl,浓度为3mg/ml荧光素工作液3)注射入体内10-20 min(待光信号达到较好的稳定平台期),再进行成像分析。注:建议对每只动物模型都需要建立荧光素酶动力学曲线,从而确定最高信号检测时间和信号平台期。
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