CCK8细胞增殖毒性检测试剂盒使用要求

　　1.细胞接种

　　细胞数量：通常细胞增殖实验每孔加入约2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入5000～10000个细胞。具体数量需根据细胞的大小、细胞增殖速度等决定。

　　培养时间：一般建议贴壁生长24小时，让细胞充分贴壁且生长状态稳定，便于后续实验操作与结果分析。

　　接种混匀：接种时注意细胞悬液一定要混匀，避免细胞沉淀导致每孔中的细胞数量不等。可以每接种数孔即混匀一下，确保细胞分布均匀。

　　2.药物处理

　　设置对照：需设置空白组和对照组，空白组不加细胞只加培养基，用于扣除本底OD值；对照组加入细胞和培养基但不添加药物，用于对比药物处理组的细胞存活情况。

　　药物浓度与体积：根据实验目的和细胞特性，配制不同浓度的药物溶液，并按一定体积加入到相应的细胞孔中，如每孔加入10μL不同浓度的药物刺激液。

　　3.孵育条件

　　温度：一般哺乳动物细胞建议在37°C下进行孵育，其他种属的细胞可根据其特定的细胞培养条件选择合适的温度。

　　气体环境：需在含5% CO?空气及湿度的细胞培养箱中孵育，以维持细胞的正常生长环境。

　　孵育时间：根据不同实验细胞需求选择适当的孵育条件和时间。例如，加药后的孵育时间可设置时间梯度，通过观察数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（一般在1.0左右）等来选择孵育时间。

　　4.CCK8试剂添加

　　添加时机：在药物孵育结束后，向每孔中加入适量的CCK-8溶液，一般为10μL。注意不要在一开始就加入CCK-8，否则会影响药物的作用效果和检测结果的准确性。

　　试剂用量：按照说明书的体系加入合适的CCK-8含量。如果细胞体系较大，可适当增加CCK-8的量，但要注意避免试剂过量或不足影响检测结果。

　　5.CCK8细胞增殖毒性检测试剂盒吸光度测定

　　测定波长：使用酶标仪在450nm处测定吸光度，此波长是CCK-8试剂检测的适宜波长。

　　测定时间：在加入CCK-8试剂后，需再次孵育一段时间再进行吸光度测定。对于不同的细胞类型，孵育时间有所不同，如白细胞较难显色，可能需要较长的CCK-8反应时间或增加细胞数量；悬浮细胞与贴壁细胞相比也较难显色，孵育时间一般为1-4小时，多数细胞在培养30分钟左右即可肉眼观察到明显的显色反应，培养3.5-4小时左右检测效果佳。

　　6.结果计算与分析

　　细胞存活率计算：细胞存活率=（实验孔OD值-空白孔OD值）/（对照孔OD值-空白孔OD值）×100%，通过该公式计算出各组细胞的存活率，从而评估药物对细胞的增殖或毒性影响。

　　数据分析：尽量多设置复孔，取平均值以减少误差。同时，可通过绘制细胞存活率曲线等方式直观地展示药物浓度与细胞存活率之间的关系。